ACE2-IgG4 Fc融合タンパク質を釣り餌として鼻腔に発現させるAAVベクターを用いたSARS-CoV-2の感染阻害遺伝子治療

University of Pennsylvania, Philadelphia, USAのグループは、COVID-19を感染阻害する為に、AAVベクターに乗せたACE2-IgG4 Fc融合タンパク質を釣り餌として鼻腔内にスプレーするという遺伝子治療を提案しています。
https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1009544

SARS-CoV-2の幅広い変異に対して1,000倍アフィニティーを改善したACE2タンパク質を開発し、それをIgG4 Fcと融合することでSARS-CoV-2に対する釣り餌タンパク質としました。最も優れたSARS-CoV-2に対する釣り餌となる融合タンパク質を CDY14-Fc と名付けました。このアフィニティー・マチュレーションは、酵母ディスプレイによる (>108にも上る) ACE2 変異体フォーマットを用いて実現されました。

CDY14-Fc がSARS-CoV-2の各種変異株(B.1.1.7/アルファー変異株、417N/484K/501Y from B1.351/ベータ変異株、452R/484Q from B.1.617.1/カッパー変異株などなど)を中和できることが下図のように示されており、抗体とは異なり、釣り餌タンパク質の方がより広い中和活性を示し、変異株に対する有効性を持っているようです。

この方法のゴールは、釣り餌タンパク質をコーディングしたAAVベクターをスプレーで鼻腔内に噴霧し、鼻腔内で釣り餌タンパク質を発現させることです。このアイデアの有効性は、類人猿を用いたin vivo実験にて検証されました。

SARS-CoV-2のoligo-mannoseとS2のHR1ドメインを両睨みする二価タンパク質でSARS-CoV-2の感染を抑える

Hanghai Institute of Infectious Disease and Biosecurity, Fudan University, Shanghai, Chinaらのグループは、SARS-CoV-2の感染を抑える為に、SARS-CoV-2 Spikeタンパク質のoligo mannoseとS2サブユニットにあるHR1ドメインを両睨みする二価タンパク質を開発しました。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8264481/

宿主細胞に感染する為に、 SARS-CoV-2 はSpikeタンパク質のS1サブユニットに存在するRBDを介して宿主細胞表面のACE2と結合します。その後、プロテアーゼによる切断を受けて、SpikeのS2サブユニットの構造変化が起こり、HR1 と HR2ドメインの間にsix-helix bundle(6-HB)が形成され、膜融合に向けてウイルスと宿主細胞を橋渡しします。それ故、SARS-CoV-2の膜融合と侵入を阻害する為には、S1、S2両方のサブユニットが重要なターゲットとなり得ます。S2サブユニットの構造は、S1サブユニットよりも保存されている為、コロナウイルスの感染阻害に対しては、より適応性が高いと考えられます。

著者らは、抗ウイルス活性を示すレクチンであるGRFT(oligo mannoseに結合特異性を有する)と、HR1ドメインに対する阻害ペプチドであるEK1を含む二価タンパク質を作り上げ、SARS-CoV-2の変異株やその他コロナウイルスへの阻害効果を評価しています。3種の二価タンパク質(GRFT と EK1を含む)プラスミドを作り上げ、リコンビナントタンパク質を得ました。3種のそれは、GRFTとEK1の間のリンカー構造がその長さという点で異なっており、具体的には次のような3種のリンカー、L15 (GGGGS)3、L25 (GGGGS)5、(GGGGS)7 を使っています。出来上がった3種のリコンビナントは、次のように命名されました、GRFT-L15-EK1 (GL15E)、GRFT-L25-EK1 (GL25E)、GRFT-L35-EK1 (GL35E)。

評価の結果、GL25E 最も優れた阻害効果を持つことが示されました(下図参照)。

NiclosamideのSARS-CoV-2感染阻害:SARS-CoV-2のエンドサイトーシスを利用した感染経路の阻害

National Centre for Biological Sciences (TIFR), Bengaluru, Indiaらのグループは、SARS-CoV-2 感染におけるエンドサイトーシスを利用した感染経路の重要性について述べています。
https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1009706

ウイルス感染におけるキーとなるステップは、ウイルス遺伝子の宿主細胞の細胞質内への放出にあります。これを行うために、ウイルスは細胞膜上の特定の受容体に結合し、引き続いて直接的に細胞膜と融合、あるいはまたエンドサイトーシスによる取り込みに引き続いて細胞膜融合を行います。この両方の細胞感染ルートは、SARS-CoV-2 の感染において起きているようであり、宿主細胞膜上の受容体やプロテアーゼの可用性に依存しています。Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) がSARS-CoV-2の良く知られた受容体でありますが、他の受容体(C-型レクチンなど)や共受容体(ヘパラン硫酸など)が数多くのグループから報告されています。 加えて、SARS-CoV-2 は、侵入を果たすには、宿主細胞のプロテアーゼによるウイルスのSpikeタンパク質の切断を必要とします。それ故、ウイルスは、もしもSpikeタンパク質が細胞膜上のTMPRSS2のようなセリンプロテアーゼによって切断される場合には、細胞膜上で直接的に融合し、そうでない場合には、エンドーライソソーム経路を細胞膜融合に使用し、そこではSpikeタンパク質は、システインプロテアーゼである cathepsinによってSpikeタンパク質がプライム状態になります。このようにして、宿主細胞におけるウイルスの侵入と感染は、これらのキーとなる要素、すなわち受容体(ACE2など)やプロテアーゼ(furin, TMPRSS2, cathepsin)の存在によって大きく影響されます。

CLIC/GEEC (CG) 経路は、clathrin-非依存のエンドサイトーシス経路(CLICs)である細管小胞輸送(tubulovesicular primary carriers)によって媒介されます。細管小胞は細胞膜から直接的に発生し、その後グリコシルホスファチジルイノシトール(GPIアンカー)濃縮小胞(GEECs)と呼ばれる細管小胞へと成熟していきます。

著者らは、ACE2の発現をコントロールした胃上皮細胞(AGS)を用いて、SARS-CoV-2 Spikeタンパク質のRBDのエンドサイトーシスを研究しています。AGSは、通常ではACE2を発現していない細胞株として認識されています。 このAGSにおいては、RBDは、clathrin-mediated endocytosis (CME) 経路ではなく、CG 経路によって取り込まれており、AGS細胞における薬理的な擾乱に敏感であることがわかりました。

AGS細胞におけるACE2の効果を調べるために、ACE2を異所的に発現させた安定株(AGS-ACE2)を作りました(ACE2 の発現は、qPCRとウエスタンブロットによって確認されました)。このように改変したAGS-ACE2 細胞においては、RBDの取り込みは、AGS細胞に比べて3倍ほど増加していました。AGS-ACE2細胞におけるRBDの取り込み経路を確認する中において、RBDとトランスフェリンの増加が同時に起こっており、AGS細胞と比較してRBDとdextranの同時取り込みが減少していることがわかりました。 このことは、CG経路に加えて、AGS-ACE2細胞においては、CME経路を介したRBDの取り込みが支配的になっていることを示唆します。

最後に、niclosamide がエンドソーム内pHを中性化し、SARS-CoV-2の感染を抑えることができることが下図のように示されました。治療薬としての可能性を示すものです。

SARS-CoV-2の変異株(B.1.617.1 = カッパー株、B.1.617.2 =デルタ株)に対するファイザーとアストラゼネカのワクチンの効果について

University of Oxford, Oxford, UKらのグループは、SARS-CoV-2の変異株(B.1.617.1 = カッパー株、B.1.617.2 =デルタ株)に対するファイザーとアストラゼネカのワクチンの効果について述べています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8218332/

カッパー株 = B.1.617.1 は、RBDにおける二つの変異(L452R と E484Q)によって特徴付けられ、デルタ株 = B.1.617.2 は、RBDにおけつ二つの変異(L452R と T478K)によって特徴付けられます。L452Rという変異は、これら二つに共通です。

著者らは、BNT162b2 Pfizer-BioNTech あるいは ChAdOx1 nCoV-19 Oxford-AstraZenecaのワクチンを接種したヒトの血清の B.1.617.1 や B.1.617.2 に対する中和活性を評価しました。

B.1.617.1 に対する幾何平均の中和活性は、Pfizer-BioNTechの場合で、Victoria株と比較して 2.7-倍減少し(p < 0.0001)、Oxford-AstraZenecaの場合は、2.6-倍減少しました(p < 0.0001)。Victoria株とは、武漢ウイルス系統であり、オーストラリアでアイソレートした株です。

B.1.617.2 に対する幾何平均の中和活性は、Pfizer-BioNTechの場合で、Victoria株と比較して 2.5-倍減少し(p < 0.0001)、Oxford-AstraZenecaの場合は、4.3-倍減少しました(p < 0.0001)。

Oxford-AstraZeneca や Pfizer-BioNTechのワクチンで得られる中和活性はこのように減少していますが、これらの変異株がワクチンで得られる中和活性を完全に亡き者にしてしまうというエビデンスはありませんので、その点には注意しましょう。

COVID-19を発症するとスフィンゴシンが減少する

Medical University of South Carolina, Charleston, USAらのグループは、血中のスフィンゴシンの減少が、COVID-19の無症状患者とそうでないヒトを早期に見分けるための高感度で特異的なマーカーになり得ると報告しています。
https://www.nature.com/articles/s41598-021-93857-7

抗体が陽性 (n = 134) と陰性 (n = 130)の比較において、スフィンゴシンのレベルが陽性者で少しですが有意に(p < 0.05)上昇していました(陽性者=28.96 vs. 陰性者=23.25 pmol/5 × 10−5 L serum)。 そして更に、COVID-19 患者においては、血中のスフィンゴシンのレベルが無症状者に比較して、15倍ほど減少していました(無症状者=28.96、COVID-19患者=1.88 pmol/5 × 10−5 L serum)。下図においては、Sphingosine (Sph)、dihydro-sphingosine (dhSph)、sphingosine 1-phosphate (Sph-1p)と略されている。

ROC解析の結果は、スフィンゴシンの閾値を 8.2 pmol/5 × 10−5 L と設定した場合に、感度 = 98.47%(95% CI 94.60–99.73%)、特異度 = 98.51%(95% CI 94.72–99.73%)が得られ、SARS-CoV-2抗体は陽性ではあるものの無症状な人とCOVID-19患者を見分けるに高感度で特異度の高いマーカーであることが分かりました。 しかしながら、スフィンゴシンとdihydro-スフィンゴシンは、重症度の見分けはできませんでした。

生化学的なバイオマーカーである lactate dehydrogenase(LDH)のレベルが、COVID-19患者の重症者で上昇しているという事が知られています。ここで発見されたスフィンゴシンのレベルの減少は重症度と相関していませんが、これらを合わせると、スフィンゴシンのレベルが高いとCOVID-19の症状を抑えることが出来、スフィンゴシンのレベルが減少すると炎症が助長される場合があると言えそうです。

SARS-CoV-2 S2のエピトープがコロナウイルスに対する交差中和抗体を誘発できる免疫原の青写真となりうる

Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, USAらのグループは、SARS-CoV-2 S2 に存在するエピトープが、コロナウイルスに対する交差中和抗体を誘発できる免疫原になり得ると報告しています。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34237283/

4名のCOVID-19回復期患者から得た198種類の抗体から、14種の中和抗体を精製しました。その内、1つはNTDをターゲット、1つはS2のエピトープを認識し、11種はRBDに結合しました。それらの IC50は、 0.007 μg/ml から 15.1 μg/mlに分布していました。

S2 サブユニットには、少なくとも1つのエピトープが、免疫原性は弱いものの、5つのヒトコロナウイルスの4つに存在しています(SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、OC43、HKU1)。そのようなエピトープは、有望な交差抗体として見つかったCV3-25に認識されており、コロナウイルスに対する広範囲な中和抗体を開発する場合の貴重な免疫原になり得ると結論されました。因みに、CV3-25のSARS-CoV-2に対するIC50は、0.34 μg/mlでありました。

Mannose特異的なレクチンを用いてSARS-CoV-2をブロックする:SARS-CoV-2にはマメ科レクチンが適する

Université Paul Sabatier, Toulouse, Franceらのグループは、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MARS-Covに対して抗ウイルス効果を示すmannose特異的なレクチンについて議論しています。
https://www.mdpi.com/2073-4409/10/7/1619/htm

植物、菌類、藻類、バクテリアなどから抽出されたMannose特異的なレクチンは、HIV-1、HPV、herpes、HCV、Ebolaウイルスらに抗ウイルス効果を示すとういう観点から多くの研究があります。このような例として、藻類レクチンのgriffithsin、シアノバクテリア由来レクチンであるcyanovirinやmicrovirin、放線菌由来のactinohivin、各種GNA-関連のレクチン(NPA や ASAなど)に関する論文が多く存在します。多くのMannose特異的なレクチンは、ウイルスの増殖を、少なくともin vitro実験下では、阻止しますが、ウイルスエンベロープに存在するMannose型のN-型糖鎖に干渉する能力に依存しています。

SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2らのSpikeを修飾するN-型糖鎖は、high-mannoseのみでなく、しばしばシアル酸修飾を伴う複合型がメジャーである場合もあります。コロナウイルス毎にこれら糖鎖の分布には違いが存在しており、Spikeのシールディングに多様性が見られます。


図の説明: ほとんどが複合型である場合 (赤), ほとんどがhigh-mannose (緑), ほとんどがハイブリッド (マゼンタ)。これらの混合であってハイブリッドが少ない場合 (ピンク)、混合でhigh-mannoseがメジャーな場合 (薄緑)、混合でハイブリッドがメジャーな場合 (オレンジ)。SARS-CoV-2の場合には、high-mannose は基本的に3分岐であり、GlcNAc2-Man5–9の構造となっているが、その中でもメジャーな構造はGlcNAc2Man5となっている。

植物、菌類、藻類、バクテリアなどから抽出されたMannose特異的なレクチンは、それぞれに糖鎖結合性はすこしづつ異なるが故に、結果として、各種のコロナウイルスを特異的に認識するようなプローブ・パネルを形成することが可能であります。このような観点から、MERS-CoVに対しては、GNA-関連のレクチンや藻類やシアノバクテリア由来のレクチンが適しており、SARS-CoVやSARS-CoV-2に対しては、trimannoside Manα1,3Manα1,6Man coreに特異性を持つマメ科レクチンが適しています。

Pfizer mRNA ワクチンを二回接種で作られるSARS-CoC-2のRBD, NTD, S2をエピトープとする抗体の特徴について;変異株に対する影響は少ない

Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, USAらのグループは、Pfizer mRNA ワクチン接種後にできるSARS-CoV-2に対する抗体の特性を報告しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8185186/

ワクチンを二回接種後、一週間ほどでピークを迎え、その後は徐々に減少していきます。興味深いのは、β-コロナウイルス OC43 や HKU1に対する抗体力価がワクチン接種後にブーストされたということでしょう。

mRNAワクチンによって誘起される抗体の主要なエピトープは、RBD と NTD であり、その他の大半はS2をエピトープとしていました。 SARS-CoV-2のUSA-WA1/2020 株を用いて、これら抗体の中和活性を測定した結果は、一部の抗体のみが中和活性を示すようです(下図参照、3名の試験者から: V1、V5、V6)。

更に、6人の試験者から得た血清に対して、変異株に対する抗体力価が評価されました。どの変異株に対しても抗体力価の低下は、せいぜい2倍程度に収まっています(E406Q、N440K、E484K、F490K)(下図参照、6名の試験者から:V1-V6).
この結果は、Pfizer mRNA ワクチンが多くのSARS-CoV-2変異株に対して有効であることを示唆するものであり、GOODニュースですね。

ロサルタン(高血圧の治療に使用されるACE2受容体拮抗薬)、第二相治験で効果を認めず治験を終了する

University of Minnesotaらのグループは、SARS-CoV-2の治療薬としてのACE2阻害剤であるロサルタンの第二相治験結果からロサルタンに治療効果はないとする結論を出しました。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8225661/

この治験は、米国、ミネアポリスにおいて、昨年4月から11月にかけて行われたCOVID-19の治療を目的とするダブルブラインド・プラセボ治験を3か所で行ったものです。

試験介入は、ロサルタン 25mgであり、プラセボも同様です。 eGFR >60 mL/min/1.73 m2の対象者については、日に二回ロサルタンを10日間に渡って服用してもらい、eGFR 30–60 mL/min/1.73 m2の対象者については、日に一回の服用としています。ACE2阻害に対するスレッショールドは、日に20mgとされており、体内での半減期が6~9時間であることから、日に1回よりは2回の方が効果があるとされています。このドーズについては、FDAの最大ドーズ量と安全性の観点から日に50mgが最大とされており、その基準に従っています。このドーズでは、ACE2に対して37%の阻害効果があるとされています。

結果として、しかしながら、治療効果は何も認められず、ウイルス量もどの時点で測定しても差異は認められず、治験は終了しました。

Fcγ受容体を介したエフェクター効果と抗体依存性感染増強 (ADE):SARS-CoV-2の治療用抗体に関して

Biological Defense Program, DSO National Laboratories, Singaporeらのグループは、SARS-CoV-2中和抗体のFcを介したエフェクター機能について研究しています。
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0253487

抗体依存性感染増強 (ADE)は、治療薬として抗SARS-CoV-2抗体を使用する場合の大きな懸念として存在しています。ADEは、Fcγ受容体が関与して、食細胞における感染を増強した場合に起こります。ADEの可能性を排除するために、Fcγ受容体が関係しない例えばIgG4アイソタイプを使用したり、FcγR-null LALA 変異を人工的に導入するというような手法がとられます。しかしながら、これらの手法は逆効果をもたらし、抗体の持つ能力を下支えするシグナルパス、例えばFcγ受容体を介したADCC効果、を殺してしまうはずです。この問題に答えるために、著者らはSARS-CoV-2回復期患者からRBDに結合する中和抗体IgG1を抽出し(SC31と命名)、その治療効果をそのLALA変異体と比較する実験を行い、SC31はADEを起こすことなく、Fcγ受容体がかかわるINF-γらの抗ウイルス応答を示しました。

SC31の治療効果におけるFcγ受容体を介したエフェクター効果を確認するために、SC31とそのLALA変異体の比較を行っています。 FcγRIIIa ADCCシグナルパスの上流の活性化を評価するために、ADCC reporter assayを組み込んだFcγRIIIaを発現するJurkat reporter 細胞株を使用し、SARS-CoV-2 Spikeを発現するようにしたHEK293T株を共培養して、蛍光を測定しました。SC31のLALA 変異体とは異なり、SC31においては、ドーズ依存性を持ちながらADCCシグナルの活性が見られました。