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アプタマーを用いて糖鎖とペプチド構造を両方同時に認識させる:前立腺癌のマーカーであるPSAをモデルとして

Universidad de Oviedo, Spainのグループは、human prostate specific antigen (hPSA)の糖鎖とそのペプチド構造を両方同時に認識できるアプタマーをSELEXにて開発しています。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34094206/

hPSAの糖鎖とペプチド構造を両方認識させるアプタマーを開発するために、α1-6 core-fucoseに特異性を有するPhoSLレクチンを糖鎖修飾サイトに特異的なアプタマーを引っかける確率を上げる為に使用しています。

SELEXのプロセスは、磁気ビーズ(MPs)にhPSA或いは糖鎖を持たないrecombinant PSAを固定化することから始まります。BSAをブロッキング材として使用し、BSAに結合するアプタマーをBSA-MPsを用いて除去します。rPSA-MPsを用いて糖鎖修飾位置とは異なったタンパク質領域に結合するアプタマーを除去します。そしてhPSA-MPsを用いてPSAの糖鎖に結合するアプタマーのライブラリーをエンリッチします。

この後、ふたつのルートに分けますが、戦略Aでは、PhoSLでブロッキングすることにより、ブロッキングされたタンパク質に結合している分子をより厳格に除去する選択を行い、戦略BではPhoSL結合サイトに結合している分子を競合的にエルーションさせます。戦略Aでは、hPSAに結合するアプタマーは減少しますが、PhoSLを用いた競合的なエルーションは、hPSAに結合するアプタマーを増やすとともにその結合力を上げていきます。

下図は、得られたアプタマー(PSAG-1)の結合特異性を示すものですが、ふたつのCure fucoseを持つタンパク質、lipocalin-2 (NGAL) と α-fetoprotein (AFP)が参照されています。前立腺癌に特異的な糖鎖構造をより精密に認識できるこのようなアプタマーが開発できれば、この方法に期待が持てます。

SARS-CoV-2の感染は、細胞間感染でも広がる:ACE2はその場合感染のメディエーターとしてさほど重要ではない

Ohio State Universityらのグループは、SARS-CoV-2感染拡大に、細胞間での直接的な感染が一役買っているといると述べています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8183005/

ACE2は、SARS-CoV-2やSARS-CoVの主要な感染受容体となっています。SARS-CoV-2やSARS-CoVとACE2の結合を介した感染は、下図に示すように宿主細胞のACE2の発現増加とともに線形的に上昇します。しかしながら、興味深いことに、SARS-CoV-2の細胞間感染は、下図に示すようにACE2の比較的低い濃度で飽和し、細胞間感染の最大値に達した後、ACE2の発現上昇とともに逆に減少し始めます。このSARS-CoV-2の細胞間感染のパターンは、通常の感染パターン(cell-free infection)とは違っており、ACE2を介した感染とは独立に細胞間感染が起こっていることを示唆しています。

興味深いことに、細胞間感染の場合でも、エンドソーム経由の感染パスは生きているようであり、SARS-CoV-2やSARS-CoVのウイルス糖タンパク質を開裂する酵素をブロックするCatL inhibitor IIIや、エンドソームのpHを中性化するBafA1らで、細胞間感染が抑制されることが下図に示されています。

SARS-CoV-2に感染して一年後の抗体の自然進化の様子

Rockefeller Universityらのグループは、SARS-CoV-2に感染してから1年後の自然抗体の様子について報告しています。
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.05.07.443175v2.full

ワクチンを接種していない回復期患者の場合、抗RBD-IgGは感染後6カ月から1年の間維持されていました。ワクチンを接種した場合は、抗RBD-IgGのレベルがほとんど30倍近くも上昇していました(下図において、Vacは、ワクチン接種を受けたことを示す)。

63人の血漿中和活性をSARS-CoV-2 Spikeタンパク質を発現するHIV 偽ウイルスを用いて測定しています。感染後12カ月で、ワクチン接種を受けていない37名の中和活性(NT50)は75であり、感染後6.2カ月のそれとほとんど違いませんでしが、ワクチン接種を受けた人では、NT50の値は3,684に達し、これはワクチン接種を受けていない人のほとんど50倍にもなっていました。

時間経過とともに中和活性に広がりがあるかどうかを確認するために、60人の中和活性をRBDの変異(R346S、K417N、N440K、A475V、E484K、N501Y)を含むパネルを用いて評価しています。下図のように、K417N、N440K、A475V、E484K、N501Yに対して中和活性が上昇しているのは明らかであり、このことは時が経つにつれて、抗体の中和活性の幅が広がって進化していることを示しています。

海はレクチンの宝庫

ムラサキインコガイ、カイメン、サザエ、カメノテ、ナマコ、ヒトデ、アメフラシ、ウニ、・・・。
未発見のレクチン探索の旅は今日も続く・・・・

Human Surfactant Protein Dが新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)感染を阻害するらしい

National Cheng Kung University, Taiwanらのグループは、human surfactant protein D が、SARS-CoV-2感染に対して感染阻害という観点で潜在的な治療効果を有すると述べています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8161545/

Human surfactant protein D (SP-D) は、コレクチンの一種であり、コラーゲンを含んだC-型レクチンであり、肺の恒常性や免疫にかかわる肺サーファクタントに含まれています。 このSP-Dのリコンビナントフラグメントである(rfhSP-D)がSARS-CoV-2に対する感染阻害効果を持つかどうかを調べるために、SARS-CoV-2 Spikeタンパク質を発現する偽レンチウイルスを使用して感染実験が行われました。rfhSP-D は、SARS-CoV-2 S1 に対してドーズ依存的に結合し、この結合はmaltoseやEDTAで阻害されました。また、この実験では、SARS-CoV-2 RBDがない場合には、rfhSP-Dは全く結合しませんでした。

rfhSP-D と Spikeタンパク質の結合がEDTA や maltose によって阻害されるということは、rfhSP-D がSARS-CoV2 Spikeの糖鎖に結合しているということを示唆するものです。偽レンチウイルスの感染効率を調べるためにルシフェラーゼ・レポーター・アッセイが使用されました。ACE2を過剰発現するように遺伝子導入されたHEK293Tに対してSARS-CoV-2を未処理で感染させたときのに比較して(これを1 RLUとする)、rfhSP-D (5 or 10 µg/ml) の処理で、0.5 RLUに蛍光が減少しました。この顕著な蛍光の減少は、rfhSP-Dの処理がSARS-CoV-2の感染を阻害していることを示しています。

これらの実験結果は、rfhSP-D の SARS-CoV-2 感染に対する潜在的な治療効果を示すものです。

ACE2とSARS-CoV-2 RBDの結合に対する糖鎖修飾(Oligomannoseおよびbi-antennary complex N-glycan)の影響

Los Alamos National Laboratoryらのグループは、SARS-CoV-2のRBDとACE2との結合性に対する糖鎖の影響を分子動力学を用いて検討した結果を報告しています。
https://www.mdpi.com/1999-4915/13/5/927

ACE2に6個のOligomannose (MAN9)が Asn53, Asn90, Asn103, Asn322, Asn432, Asn546の位置に修飾され、SARS-CoV-2のRBDにbi-antennary complex N-glyucan(FA2)がAsn343の位置に修飾されているとした場合と、これらすべての糖鎖修飾位置がbi-antennary complex N-glycanであるとした場合をモデルとして結合力を計算しています。下図では、MAN9は赤色で、FA2は青色で示されています。

結果、ACE2の糖鎖修飾がMAN9である場合には、結合力が14.7%減少し、それがFA2である場合には、9.1%上昇することが示されました。

ACE2の修飾をhigh mannose型にした場合は、感染力が若干下がるという実験結果があり、矛盾はしていないようです。

また、N501Y変異で、何故感染力が上がるかについても計算されており、芳香環のπーπ相互作用の影響が指摘されています。この点については、既に過去のブログ記事で同様な研究例を紹介しています。

SiglecのN-型糖鎖結合特異性について:糖鎖アレイを用いた実験から

Georgia State Universityらのグループは、Siglecの糖鎖結合特異性について、糖鎖アレイを用いて検討した結果を報告しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8116747/

Siglec-3、-9、-10 は、α1-3 branching構造の場合にはSiaα2-6Galβ1-4GlcNAcに対するアフィニティーが強く、逆にα1-6 branching構造の場合には、Siaα2-3Galβ1-4GlcNAcに対するアフィニティーが高いことが分かりました。更に興味深いことに、Siglec-10は、Neu5Gcに対するアフィニティーが高いことが分かりました。

SARS-CoV-2を含む強い病原性を持つウイルスによって引き起こされるサイトカイン・ストームの特徴について

強い病原性を持つウイルスは通常サイトカインン・ストームをひき起こし、体組織に副作用的にダメージを与え、死亡率を高めます。
Sichuan Agricultural University, Chinaらのグループは、各種ウイルス(コロナウイルス (SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS-CoV-2)、インフルエンザウイルス (2009H1N1, H5N1 and H7N9)、エボラウイルス、HIV、デングウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、HBV、HCV、エンテロウイルス)によって引き起こされるサイトカイン・ストームの特徴を解析し、次の三つの特徴を描き出しました。
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.659419/full

IP-10、L-6、IL-8、IL-17が最も増加するサイトカインである

IFN-γ と IL-4 の変化が全てのサイトカイン・ストームの増幅率を決定する
IL-4とIFN-γが免疫応答の開始と制御に大きく関わっています。というのも、これらは相互に相反する機能を持っているからです。IFN-γ はTh2-細胞の分化を阻害し、Th1-細胞を安定化させます。IL-4は、逆にTh2-細胞の分化を誘導し、Th1-細胞の分化を阻害します。サイトカインストームの増幅率は、IFN-γ Fold Change(FC)/IL-4 FCという比で表現されるべきで、もしもIFN-γ FC/IL-4 FC が1よりも小さい場合は、増幅率は逆数の IL-4 FC/IFN-γ FCという比で表現されます。[IFN-γ FC × (IFN-γ FC/IL-4 FC) (if IFN-γ FC/IL-4 FC > 1)] 或いは [IFN-γ FC × (IL-4 FC/IFN-γ FC) (if IFN-γ FC/IL-4 FC < 1)] と最大FCの間の相関係数は、何とR2 = 0.988に達しました。

ウイルス量はIFN-γ FCと正に相関し、ウイルス排除速度はIFN-γ FCと負に相関する

SARS-CoV-2のARDSで命を落とした患者の検死結果が物語るCOVID-19の病理:ウイルスがマクロファージに直接感染する

Karolinska University Laboratoryらのグループは、COVID-19のARDSが死亡の直接の原因である12名の患者の検死から、新たな病理知見を報告しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8141733/

COVID-19で引き起こされるARDSにおいては、肺は液体で満たされて重く、広範囲にゴム状に硬化していました。このプロセスは、肺細胞におけるウイルスの増殖によって引き起こされ、肺胞上皮や肺胞毛細血管と肺胞内空間との間のバリアの破壊が大規模に進んだ結果です。この破壊が進行するにつれて、浮腫液や更には全血が肺胞空間に流れ込み、肺胞空隙が消失します。 血液凝固のカスケードが始まると、フィブリンの蓄積が進み、肺胞内の血液も凝固してしまいます。重要なことは、肺細胞のほんの少数しか溶菌感染を起こしておらず、大部分の肺細胞は細胞質の膨れ、小胞変性、核異型というような形での細胞変性効果を示しているということです。

興味深いことに、ウイルスは肺細胞やマクロファージで増殖しており、気管支上皮や内皮、周皮細胞、間質細胞では増殖しておらず、その感染機構の詳細は分からないものの、マクロファージらの食細胞がウイルスを取り込んで直接自身が感染していることを示唆するものです。

ここで見られる肺の硬化は、CD163+マクロファージや骨髄系細胞の大規模な蓄積、過剰な上皮細胞や間質細胞の増殖反応、あふれんばかりの血管新生らを伴っています。 このような肺の硬化をひき起こす内皮のダメージは、ウイルス感染による直接的な細胞変性ではなく、大規模なバイスタンダー効果によって引き起こされたと考えられます。恐らく、ウイルスが感染した肺細胞から放出されるアポトーシスを誘導するORF3aらの液性因子によって誘起されたものと考えられます。

前立腺癌の尿中マーカーについて:PSAのフコース修飾が前立腺癌の進行で減少する

弘前大医学部のグループは、前立腺癌に対する尿中マーカーとその診断法に関するレビューをしています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8100853/

今日現在、FDAが認可した前立腺癌(PC)に関する診断マーカーはただ一つしかありません、それは血中PSAです。 前立腺癌が進行すると、α-2,3-Sia (S2,3PSA) と α-2,6-Sia (S2,6PSA) の比率が変動し、α-2,3-Siaが増加することが知られています。
α2,3-linked Sialyl N-Glycan-Carrying Prostate-Specific Antigen
しかしながら、同じ結果は、尿中のPSAには当てはまらず、シアル酸修飾は尿中では殆ど変化しません。

尿中PSAの場合には、PSAのフコース修飾が前立腺癌のマーカーになる可能性があります。前立腺癌では、Lewis型やコア・フコース修飾を受けたPSAが顕著に減少することが分かっています。これらは、例えば、AALやPhoSLと言ったレクチンを使って検出することが可能です。また、コア・フコース修飾されたPSAが生検サンプルのGleasonスコアーと良く相関することも分かっています。Gleasonスコアが7以上の場合で、 PSA-AALでACU=0.69 (P=0.0064)、PSA-PhoSLで0.72 (P=0.0014)という値が得られています。
Decreased fucosylated PSA as a urinary marker

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