カテゴリー: Technology

Universidade CEUMA, Brazilらのグループは、エンベロープを持つウイルスとの戦いに糖鎖とレクチンの相互作用を用いた過去の事例をレビューし、SARS-CoV-2への挑戦に触れています。
https://academic.oup.com/glycob/article/31/4/358/5934657

COVID-19に立ち向かうに際して、ウイルス・エンベロープの糖タンパク質の存在は、レクチンを用いる方法について、いろいろな可能性を与えてくれます。レクチンは、ウイルス・エンベロープの糖鎖と結合し、ウイルスの宿主細胞への感染を阻害することができるという意味において、新しい抗ウイルス薬の開発のリード高分子になり得ます。

SARS-CoV-2の糖鎖修飾の概要は次のようです。SARS-CoV-2のspikeタンパク質には、22個のN-型糖鎖修飾部位、6個のO-型糖鎖修飾部位があります。 oligomannose-型の糖鎖は、2ケ所（N234 and N709）、複合型糖鎖は、主に14ケ所（N17, N74, N149, N165, N282, N331, N343, N616, N657, N1098, N1134, N1158, N1173 and N1194）、更に6ヶ所は、oligomannose-型と複合型が混在しています（N61, N122, N603, N717, N801, N1074）。最も普通にみられるoligomannose-型糖鎖は、 Man₅GlcNAc₂であります。一方、O-型糖鎖は短鎖にて、Tnやcore1構造が主であります（T73, T76, T478, T676, T678, T1076）。

このレビュー論文で触れられている抗ウイルス薬として評価された典型的なレクチンは（FRAIL, GRFT, Cyanovirin-N, BanLec, MVN, Avaren）であります。これらのレクチンの糖鎖結合特異性は、ほとんどがoligo及び high mannoseでありますが、これは過去にターゲットとされたウイルス（HIV, HCV, influenza, Ebora）のエンベロープは、強くmannose修飾を受けていたことに関係します。これらウイルスに比較すると、SARS-CoV-2の糖鎖修飾は幾らかパターンが異なっているということができますし、従って、これらのレクチン以外に、SARS-CoV-2と戦うにはより優れたレクチンが存在する可能性があるでしょう。

ともあれ、抗ウイルス薬としてレクチンを使う場合の大きな制限は、ターゲット以外の望ましくない体細胞に結合してしまう可能性があるということにあります。例えば、レクチンを投与することで、凝集反応や細胞増殖を招いてしまうというような事柄があります。従って、レクチンを使うことによるそういった副作用を抑えながら、SARS-CoV-2に対する特異的な抗ウイルス薬としてのみ働くようにレクチンをタンパク質工学を用いて工夫してやることが必要です。おそらくそのキーワードは、融合タンパク質を作るということではないでしょうか？例えば、Fab融合, Fc融合, PEG化、などなどです。

Israel Institute for Biological Researchらのグループは、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のNTDに対する12種類の中和抗体の特性について報告しています。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33937725/

12種類のSARS-CoV-2 NTDをターゲットとする抗体 (BLN1 ～ BLN14) は効果的にSARS-CoV-2を中和化することができ、そのIC₅₀は、最も低い中和活性のBLN8で54.9 µg/ml、最も高い中和活性を示すBNL1やBLN12で0.008 µg/ml、に分布しました。　これらすべての抗体の特異性は、NTDをターゲットとするELISAにて検証され、より詳細には、S1タンパク質の配列から作られたペプチドアレイによるエピトープマッピングにて検証されました。 そしてまた、NTDの糖鎖修飾の抗体への影響については、糖鎖アレイ、及び糖鎖を阻害剤として用いる競合アッセイによって評価されました。糖鎖アレイの実験では、これら抗体は、ほとんどの糖鎖に対して非常に弱い結合しか示しませんでしたが、LacNAcとそのα2-3Sia修飾については強く結合しました。これらの結果から、BLN4とBLN12は、NTDのアミノ酸配列のみでなく、N-型糖鎖もその結合に関与している可能性が指摘されました。

SARS-CoV-2においては、ACE2が主たる感染受容体として考えられていますが、C型レクチン（L-SIGN, DC-SIGNなど）も感染受容体として機能することが報告されています。そこで、代表的な抗体がSARS-CoV-2とL-SIGNの結合を阻害できるかどうかについての実験が行われました。 阻害効率は、BLN14の25％からBLN4の50％に分布しました。この阻害効果は、抗体のNTDの糖鎖に対する直接的な結合によって引き起こされるものではなく、L-SIGNとの立体障害によって引き起こされているものだと考えられました。

ACE2の発現が低い組織の細胞の場合に、L-SIGNやDC-SIGNがSARS-CoV-2に対する第二の感染受容体となるのであれば、NTDをターゲットとする抗体がSARS-CoV-2の感染を抑え込むために有効であると考えられ、結果として、RBDをターゲットとする抗体とNTDをターゲットするカクテル抗体がSARS-CoV-2の治療に有効であるはず、と結論しています。

University of Pisa, Italyらのグループは、潰瘍性大腸炎における新しいバイオマーカーについて報告しています。
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2021.654319/full/

潰瘍性大腸炎（Ulcerative colitis: UC）は、自己免疫疾患であり、大腸上皮細胞に炎症が発生し、出血、下痢、腹痛が起こります。 腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor: TNF）の発現が潰瘍性大腸炎では上昇しており、 大腸粘膜に炎症を起こし、大腸上皮細胞にダメージを与えています。このようなことから、抗TNF抗体, infliximab (IFX) や adalimumab (ADA), が潰瘍性大腸炎の治療に使用されています。.

しかしながら、潰瘍性大腸炎の患者の30％は、この抗TNF抗体が効かない（non-responder）ということもあり、治療効果に対して早期に予測ができることが非常に重要になっています。著者らの研究は、抗TNF抗体治療に対する治療効果を予測する上で、IgGのJacalin（JAC）結合性糖鎖が非常に良いマーカーになると述べています。下図において、Aは治療前のJAC-IgGのベースラインを示し（NHS = 健常者, R = レスポンダー, NR = ノンレスポンダー）、Bは抗TNF抗体治療後のそれを示します。
Jacalinは、O型糖鎖を認識するレクチンであり、IgGのこの糖鎖修飾の違いがどのように抗TNF抗体の治療効果に関係しているのか？については不明ですが、治療効果に対するバイオマーカーには成り得るとしています。

多くの自己免疫疾患では、IgGの糖鎖修飾がアガラクトに変化することが知られており、FcγRIIaとの相互作用を介してマクロファージの活性化や、TNFα、IL-6ら炎症性サイトカインの産生を促すことが知られています。また、リューマチでは、ステロイドや抗TNF抗体を投与することで、IgGのシアル酸修飾が増加するという現象も知られています。

Medical University of Białystok, Polandらのグループは、トシリズマブ（Tocilizumab）のCOVID-19に対する治療効果を報告しています。
https://www.mdpi.com/2077-0383/10/8/1583/htm

合計825名の患者の内、170名にトシリズマブが投与され、655名にはトシリズマブは勿論のこと他の如何なるサイトカイン受容体に対する阻害剤（mAb）も使用されませんでした。トシリズマブのドーズは、一回の投与で、8mg/kgにて、最大ドーズは800mgとされました。

IL-6のレベルが100pg/mLより高い場合に、トシリズマブの顕著な効果が表れ、hazard ratio [HR]=0.21（95% confidence interval [CI]: 0.08–0.57)となりました。IL-6のレベルが100 pg/mLより高く、且つ酸素飽和度が90%以下あるいは酸素吸入が必要な場合で、更に効果が顕著となり、HR=0.18となりました。付け加えるならば、IL-6の濃度が100pg/mLよりも低い場合には、トシリズマブはほとんど効かないという結果でもあります。
しかし、トシリズマブがどのような状態の時に、如何なるドーズが最適なのか？という知見が得られたことは非常に素晴らしいと思われます。

Aarhus University Hospital, Denmarkらのグループは、経口蛋白分解酵素阻害剤（Camostat Mesilate：TMPRSS2阻害剤）のCOVID-19への治療効果を報告しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8060682/

本試験では、ダブル・ブラインド、ランダム化、プラセボコントロールの治験が実施されています。この治験の背景は、TMPRSS2を阻害することによって、感染患者におけるSARS-CoV-2の増殖を阻止し、急性呼吸器不全に至る重症化のリスクを下げられるかも知れない、ということにあります。しかしながら、試験結果は誠に残念なものであり、経口蛋白分解酵素阻害剤（Camostat Mesilate：TMPRSS2阻害剤)は、COVID-19患者に対して、急性呼吸器不全による死亡、挿管、酸素吸入期間、入院期間らあらゆる項目に対して有意差を認めませんでした。

本治験において、camostat mesilateのドーズが最適されていなかったのではないか？という疑念は残りますが、 ブログ管理人は、ACE2-TMPRSS2によってイニシエートされるという感染パスが実は肺上皮細胞ではメジャーでなく、免疫細胞に発現するC-Type lectinや食作用を介した感染ルートがメインになっているのではないか？という疑念をぬぐい切れません。

第一三共のグループは、抗体医薬品としてのmAbを製造するCHO細胞について、その培養条件の最適化を図っています。
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0250416

著者らは、CHOの培養に低分子化合物を添加することで、mAbの生産性を上げ、糖鎖構造の制御も合わせて行うことを考えています。
23,277種類の低分子化合物からスタートし、mAbの濃度が120％以上に増加、生産性が105％以上に増加、CHO細胞の生存率が80％以上であることというスクリーニング条件を経て、最終的に残った数個の低分子化合物の中から、4-(2,5-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)-N-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) benzamide (MPPB)が選択されました。MPPBの濃度は、0.32 to 0.64 mMであり、mABの生産性は結果として1.5倍に上昇したとのことです。
糖鎖構造についてもG0Fがメインとなり、G1Fの割合が24.5%から14.8%に低下しました。その他の構造については変化はないようです。

McMaster University, Canadaらのグループは、COVID-19の治療薬としてのランダム化比較試験をHydroxychloroquine, Lopinavir, Ritonavirに対して行った結果を報告しています。
https://jamanetwork.com/journals/jamanetworkopen/fullarticle/2779044

ランダム化比較試験はブラジルにて実施され、そのサンプルサイズは、hydroxychloroquineに対して214名; lopinavir-ritonavirに対して244名; プラセボに227名でありました。
ウイルスの排除に関して、hydroxychloroquine（odds ratio [OR], 0.91; 95% CI, 0.82-1.02）、lopinavir-ritonavir（OR, 1.04; 95% CI, 0.94-1.16）という結果にてコントロールに対して有意差は認められない結果でした。

因みに、
Hydroxychloroquine：抗マラリアまたは抗リウマチ薬、
Lopinavir：HIV感染症のHAART療法に用いられる医薬品、
Ritonavir：HIVやHCV感染症の治療に使用される医薬品、
であります。

厚生労働省は、2020年5月に特例で承認した抗ウイルス薬「レムデシビル」に続き、ステロイド薬の「デキサメタゾン」を、2020年7月に日本国内で承認されているCOVID-19の医薬品として追加しています。デキサメタゾンがどんな役割を果たしているか？について報告している論文をご紹介しましょう。

University of Huddersfield, UKらのグループの研究報告です。
https://link.springer.com/article/10.1007/s10753-021-01464-5

PBMC（末梢血単核細胞）をSARS-CoV-2 Spikeタンパク質で刺激した場合には、炎症性サイトカインであるTNFα, IL-6, IL-1β and IL-8らが高発現します。デキサメタゾン（100nM）を用いてPBMCを前処理すると、これらサイトカインの産生が大幅に抑制されることが示されました。NF-κB転写因子、p38 MAPK、およびNLRP2インフラマソームらの活性化が炎症性サイトカインの産生を促すと考えられていますが、デキサメタゾンは、NF-κB DNA bindingを阻害する（～46％）ことが示されました。

University of Oxfordらのグループは、SARS-CoV-2の変異株P.1に対する各種治療用抗体、およびPfizer-BioNTech, Oxford-AstraZenecaのワクチンがもたらす中和抗体の活性度の変化について報告しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8008340/

P.1 変異株には次のような変異が含まれています、
NTDにおいて、L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S,
RBDにおいて、K417T, E484K, N501Y,
S1のC-末端において、D614G, H655Y,
S2において、T1027I, V1176F。

Lilly抗体 (LY-CoV16, LY-CoV555) については、中和能力が劇的に減少しました。Regeneron抗体 (REGN10933)およびAstraZeneca抗体 (AZD8895)についても、中和能力の低下が認められました。しかし、AstraZeneca抗体 (AZD1061, AZD 7442) については、ほとんど変化はありませんでした。Adagio抗体 (ADG10, ADG20, ADG30) は高い中和能力を持ち、最終的に100%の阻害能力を示しました。むしろ、ADG30 については、中和能力が若干向上しているようでもあります。

また、Pfizer-BioNTechのワクチン投与後得られた血清については、2.6倍（p<0.0001）、Oxford-AstraZenecaワクチンの場合で、2.9倍中和能力が減少しました。

Fudan Universityらのグループは、緑茶に含まれるポリフェノールであるガロカテキンガレート（Gallocatechin gallate: GCG）がSARS-CoV-2の増殖を効率よく抑えることを示しました。
https://www.nature.com/articles/s41467-021-22297-8

SARS-CoV-2のNタンパク質はRNA結合性の構造タンパク質であり、RNAを抱き込んで周囲にシェルを作ります。これは、細胞質中で細胞膜レスの油滴のような巨大分子構造を作る現象である液液層分離（Liquid-Liquid Phase Separation: LLPS）の典型例です。
SARS-CoV-2に感染した細胞中で見られるNタンパク質によるLLPSを、緑茶に含まれるポリフェノールであるGCGが効率よく阻害することが確認されました。Nタンパク質のアミノ酸配列は、コロナウイルスにおいて高く保存されており（～90％）、COVID-19のみでなく、将来の新型コロナウイルスに対する治療薬となる可能性があります。