カテゴリー: Technology

Lehigh University, Bethlehem, USAのグループは、SARS-CoV-2の各種変異株のRBDとACE2の間の結合力について、糖鎖修飾も考慮に入れた形で分子動力学シュミレーションを行っています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8328061/

SARS-CoV-2 RBDとACE2複合体に対して、RBDとACE2それぞれの重心間の距離の関数として引き剥がすに必要な引っ張り力を分子動力学シュミレーションにより評価しています。RBD-ACE2複合体については、N型糖鎖の完全修飾を仮定し、下記の6種のSARS-CoV-2変異株について計算が行われました。

アルファ変異株 (英国において発見, B.1.1.7: N501Y),
ベータ変異株 (南アフリカにおいて発見, B.1.351: K417N, E484K, N501Y),
ガンマ変異株 (日本とブラジルにおいて発見, P.1: K417T, E484K, N501Y),
デルタ変異株 (インドにおいて発見, B.1.617.2: L452R, T478K)),
イプシロン変異株 (カリフォルニアにおいて発見, B.1.427: L452R) ,
カッパ変異株 (インドにおいて発見, B.1.617.1: L452R, E484Q)),

アルファ変異株が、ACE2からの引き離しには一番強い力を必要とし、ベータ変異株、ガンマ変異株或いはデルタ変異株の順になります。ベータ変異株とガンマ変異株のK417N/T変異が、アルファ変異株に比べて力が弱くなっている原因のようです。加えて、イプシロン変異株はL452R変異によって不安定化したRBDの構造により他の変異株よりも力が弱くなっています。デルタ変異株は、RBDとACE2の距離が相対的に遠い場合に最も強い力を必要とするようです。

興味深いことに、デルタ変異株の様子は、他の変異株とは違っています。T478K変異の影響にて、RBD-ACE2間の距離が78Åで完全に分離するときに最も強い力を必要とします。何がその違いを生み出しているかなのですが、T478K変異によって、デルタ変異株のRBDとACE2bの間には他の変異株の場合よりもより多くの分子間結合点があるようです。デルタ変異株のK487は、距離=78ÅにおいてACE2のP84とM82に結合しているのですが、イプシロン変異株のT478ではこのような相互作用は消失しています。フレキシブルなループに存在する478残基がACE2と一番最初に結合するチャンスがあり、その間の強い相互作用がデルタ変異株がその高い感染力で蔓延した原因になっているのかも知れません。

Mohammed VI Polytechnic University (UM6P), Benguerir, Moroccoらのグループは、小麦の出芽と成長を促すリン固定根圏バクテリアについて報告しています。
https://peerj.com/articles/11583/

近年、植物の根と土壌細菌の共生が非常に着目されており、根圏（rhizosphere）と名付けられています。根圏は、動物の腸と腸内細菌の関係と非常に良く似ており、腸の内皮が根の上皮に相当し、腸内細菌が土壌細菌に相当します。根圏細菌や根のグライコームに関する研究は、しかしながら非常に少なく、今後新たな知見が得られる分野としてブログ管理人は多大な興味を持ってその動向をウォッチしています。

リン (P) は、窒素に引き続いて植物に必要な栄養素であり、植物の生長における殆どすべての代謝プロセス、例えば、光合成、エネルギー伝達、呼吸、シグナル伝達らに係わる必要不可欠な主要栄養素であります。バクテリアを含むリン酸塩可溶化微生物は、土地の肥沃化と植物の生長に重要な役割を果たしています。それ故、リンが欠乏している土壌での穀物の生産とその効率を最大化する為に、環境に優しく、しかも経済的な管理手法の開発が非常に大切です。根圏細菌の生物多様性の調査と根圏における微生物相互作用の最適化とその操作は、高いリンの固定化能力を持つ効果的な微生物の接種を実現する上において欠くことのできないステップであります。リンは、有機体あるいはまた無機体として土壌に多く存在するのですが、そのままでは根はリンを吸収することが出来ません。多数の土壌微生物、特に植物の根圏に存在する微生物は、それらのリンを可溶化することで、植物が吸収しやすくなります。リン酸可溶化細菌は、植物成長促進根圏細菌に属し、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン鉱石などのさまざまな供給源からの無機体のリンを可溶化することができるのです。

根圏バクテリアのスクリーニングで、下記のように9種のリン固定種が同定されました、

インドール酸 (IAA) は、植物の生長を促進することが知られています、

アンモニアは、間接的に植物の健康に寄与します。特に病原菌に対する代謝的な阻害剤として作用します。すべての土壌細菌はいろいろな濃度でアンモニアを生成しますが、シュードモナス属J153が最も高濃度のアンモニアを生成するようです。

結果として、グラム陰性土壌細菌 J12、シュードモナス属 J156の接種が、小麦の出芽と成長を最も促すことが示されました。

Jan Kochanowski University, Kielce, Polandらのグループは、COVID-19重症患者に対するトシリズマブとデキサメタゾンの使い方とその治療効果について報告しています。ブログ管理人はお医者様ではないのですが、仮に自分がそうなった場合に、治療法に対する知識があると良いですよね。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8291861/

４つのグループ（トシリズマブ（TCZ）で治療、TCZ とデキサメタゾン（DEX）両方を使って治療、DEXのみで治療、TCZ も DEXも使用していない）を比較しています。TCZのみを用いたグループで死亡率が6.8％と顕著に下がっており、他のグループでは19.6% ～ 23.1%でした。特に、IL-6の濃度が100pg/mLを超えるような患者ではTCZの効果はより顕著であり、TCZのみの場合とその他の場合で、5% 対 22.9% ～ 51.7%となりました。
感染後21日、そしてまた28日後の症状の改善にも大きな違いが出ており、TCZのみの場合で、それぞれ 60% と 75%となっており、DEXのみの場合の数値と比べると倍の効果が出ています（それぞれ、27.6% と 37.9%）。

このようにして、COVID-19の重症患者においては、特にサイトカインストームをひき起こしている場合には、死亡率、症状の改善、退院率などにおいて、TCZはDEXよりも顕著な治療効果を示しています。COVID-19重症患者の場合には、TCZとDEXを合わせて使用しても、TCZ単独の場合に比較して、治療効果には改善は見られないことは特質すべきでしょう。

Northwestern University Feinberg School of Medicine, USAらのグループは、以前にSARS-CoV-2に感染していた人と、していない人の間で、mRNAワクチンの1回或いは2回接種後のIgG中和活性に如何なる違いが生じているかについて報告しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8276631/

次の三つのグループについて比較しています：
(1)COVID-19群: COVID-19の確認された外来患者で回復した人達、
(2)血清陽性群: SARS-CoV-2のRBDに対して血清陽性ではあるが、COVID-19に対する急性ウイルス診断テストはない人達、
(3)血清陰性群: ワクチン接種前の以前のSARS-CoV-2感染に対して血清陰性の人達。

COVID-19群は、中和活性中央値％は、血清陽性群に比べて有意に高い（22.2 vs. 4.4, p < 0.001）。 COVID-19群は、ワクチン接種一回で、血清陽性群に比べて顕著に中和活性中央値％が高い（99.9 vs. 56.5, p < 0.001）。 ワクチン接種一回後、血清陽性群の中和活性中央値％は、明らかに血清陰性群よりも高いが、それほど大きく違うわけではない（56.5 vs. 38.2, p = 0.12）。 COVID-19群は、ワクチン二回接種で、血清陽性群よりも中和活性中央値が高い（99.9 vs. 98.5, p<0.001）。 血清陽性群と血清陰性群は、ワクチン二回接種後はほとんど変わらない中和活性中央値％を示す（98.5 vs. 97.9, p = 0.46）。 従って、結果としては、以前にCOVID-19患者と確認された人達は、ワクチン接種一回で十分な効果が得られるようです。

Marine Biotechnology Research Center, Koreaらのグループは、海藻から抽出した多糖類のSARS-CoV-2の感染阻害効果と細胞毒性について報告しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8071526/

海藻類は、非常に優れた生薬ソースであり、多糖類、食物繊維、アミノ酸、脂肪酸、天然色素、フタロタンニン、ビタミン、ミネラルなどが抽出できます。これらの成分は、非常に多岐にわたる薬理効果を持ち、抗腫瘍活性、酸化防止、抗細菌・ウイルス活性、抗凝固活性、免疫活性効果などが知られています。

次の多糖類について、SARS-CoV-2の感染阻害効果と細胞毒性が評価されました：
ワカメ、
ミウマコンブ、
ヒジキ、
アカモク、
アワビ内蔵、
ミル、
アサクサノリ、そして
フコイダン。

細胞毒性は、HEK293/ACE2 細胞を用いて評価され、各々の多糖類は、1 ng/mL ～ 1 mg/mL (1/10希釈系列) の濃度にてアプライされ、96時間インキュベートされました。ほとんどの多糖類は、シビアな細胞毒性は示しませんが、アワビ内蔵、ヒジキ、アサクサノリは、1 mg/mLの濃度で少々細胞毒性を示し、アワビ内蔵 の細胞毒性が一番顕著でありました。細胞毒性の強さの度合いは、アワビ内蔵、アサクサノリ、ミル、ヒジキ、ミウマコンブ、ワカメ、アカモク、フコイダンの順に並びますが、これらすべてのCC₅₀ は、500 μg/mL以上でありました。

多糖類による感染阻害効果は、HEK293/ACE2細胞にSARS-CoV-2 疑似ウイルスを用いて評価されました。アサクサノリを除くすべての多糖類がSARS-CoV-2 疑似ウイルスに対して感染阻害効果を示しました。評価された多糖類の中では、アカモクが最も高い抗ウイルス効果を示し、IC₅₀ は 12 μg/mLでありました。その他は、次のような順番になります、アワビ内蔵 (33 μg/mL)、ヒジキ (47 μg/mL)、ミル (74 μg/mL)、ミウマコンンブ (105 μg/mL)、 フコイダン (142 μg/mL)、ワカメ (289 μg/mL)、であります。

結論としては、アカモクの多糖類がSARS-CoV-2の感染阻害には最も適しているようです。

National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC), Beijing, China, らのグループは、レンズ豆レクチンが、SARS-CoV-2の変異株に対しても有望な抗ウイルス活性を持っていると報告しています。
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2021.1957720

Huh7細胞とあらかじめレクチンで前処理したSARS-CoV-2の疑似ウイルスを用いてレクチンの中和活性を評価しました。WGA、lentil lectin、PHA-L、PHA-E らがSARS-CoV-2疑似ウイルスに対して非常に優れた抗ウイルス活性を示し、そのIC₅₀は 8.5 μg/mL から 22.0 μg/mLの範囲でありました。

レクチンによる血球凝集と細胞毒性は、レクチンの応用においては常に課題となります。 PHA-L と PHA-E は、血液凝集を 3.91 μg/mLで示し、WGA は7.81 μg/mLでした。レンズ豆レクチンは、最も弱い血球凝集を示し、その値は高濃度の 1 mg/mLでありました。一方、細胞毒性はHuh7或いは293Tを使用し、37℃で24時間インキュベートして測定されました。これらすべてのレクチンは、500 μg/mLの濃度でも細胞毒性を示しませんでした。

これらのことを考慮すると、レンズ豆レクチンがSARS-CoV-2阻害には最も適していると考えられます。

レンズ豆レクチンの場合には、SARS-CoV-2 Spikeの個々のN-型或いはO-型糖鎖を除去してもその中和活性には影響はありませんでした。このことは、レンズ豆レクチンがSARS-CoV-2 Spikeの多くの糖鎖修飾サイトに結合できることを示唆しているようです。レンズ豆レクチンは、oligomannose-型糖鎖 (Man-5 ～ Man-9)に強く結合し、還元末端がGlcNAcの複合型やハイブリッド型糖鎖にも結合します。

RBDの周辺には、N165、N234、N343 に糖鎖修飾サイトがあります。これらサイトの糖鎖にはレンズ豆レクチンは結合することができます。特にN234は、完全なoligomannose-型なので、効果的に結合することができます。興味深いのは、これら3つの糖鎖修飾サイトのどれか一つを除去してもレンズ豆レクチンの中和活性には影響がなく、残った二つのサイトで十分なレンズ豆レクチンの中和活性を維持できることを示しています。

現在までに、多様なSARS-CoV-2変異株が出現しているのですが、N165、N234、N343 は 100% 保存されており、これらのことを考慮すると、レンズ豆レクチンの使用は、SARS-CoV-2変異株に対する中和活性の許容範囲の広さから、とても優れた選択肢なのかも知れません。

Technische Universität Braunschweig, Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Abteilung Biotechnologie, Germanyらのグループは、COVID-19回復期患者の末梢血単核細胞（PBMC）から抗体ファージディスプレイ法を用いて、SARS-CoV-2に対する中和抗体を開発した結果について報告しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8260561/

抗体ファージディスプレイ法は、今日ターゲット疾患に対する治療用抗体の開発におけるin vitroな技術として広く使用されています。著者らは、６人のCOVID-19回復期患者から得た免疫ファージディスプレイを使用し、SARS-CoV-2 RBDに結合する抗体を選別することによってSARS-CoV-2に対する阻害・中和抗体を開発しました。

30 種類の抗体を、IgGとしての特性評価を行うために、細胞変性効果（CPE）ベースの中和スクリーニングアッセイでスクリーニングしました。 このアッセイは、250プラーク形成単位（pfu）/ウェルSARS-CoV-2および1μg/ mL（〜10 nM）scFv-Fcを使用して実施しました。 CPEは、SARS-CoV-2感染時に4日以内に位相差顕微鏡ではっきりと見える丸みと剥離を特徴とし、感染していない細胞は普通のコンフルエンシー単層を維持していました。最高の中和活性を示す 19 scFv-Fc を再クローニングし、50mLの培養スケールでヒトIgGとして生成しました。RBD、S1、またはS1-S2への結合の最大有効濃度の半分 EC₅₀ 値が決定されました。 STE90-C11、STE90-B2-D12、STE94-F6、STE94-H2と名付けられた抗体は、全ての抗原に対して0.2 ～ 0.5 nM の範囲の EC₅₀ を示し、結果として、STE90-C11 抗体が最も優れた中和抗体であるとして選別されました。

驚くべきことに、STE90-C11 は、下図に示すように現存するほとんどの変異に対して許容範囲に入ります。特に、現在までに出現した B.1.429/B.1.427、B.1.526、B1.258Δ、B.1.535、B.1.617、B.1.1.33らの変異株に対して許容範囲にあることは特出すべきでしょう。

STE90-C11の中和メカニズムをさらに詳しく知るために、STE90-C11FabとSARS-CoV-2RBDの複合体を調製し、結晶化スクリーニングを行いました。得られた結晶から収集されたX線回折画像は、2.0Åの全体的な分解能限界に渡るデータセットをもたらしました。分子置換によって構造を解いた後、モデルが電子密度に組み込まれました。この結合領域の約60％がVHセグメント由来であり、同時に最大10個の水素結合を形成していました。残りの40％は、VLセグメント由来であり、更に8個の水素結合が相互作用を安定化させていました。 STE90-C11：SARS-CoV-2 RBD複合体のRBDとACE2：SARS-CoV-2 RBD複合体の重畳は、STE90-C11の中和活性のメカニズムは、ACE2結合サイトへの競合反応であり、SARS-CoV-2 RBDとSTE90-C11の相互作用界面はほとんどオーバーラップしていることを示します。

Hanghai Institute of Infectious Disease and Biosecurity, Fudan University, Shanghai, Chinaらのグループは、SARS-CoV-2の感染を抑える為に、SARS-CoV-2 Spikeタンパク質のoligo mannoseとS2サブユニットにあるHR1ドメインを両睨みする二価タンパク質を開発しました。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8264481/

宿主細胞に感染する為に、 SARS-CoV-2 はSpikeタンパク質のS1サブユニットに存在するRBDを介して宿主細胞表面のACE2と結合します。その後、プロテアーゼによる切断を受けて、SpikeのS2サブユニットの構造変化が起こり、HR1 と HR2ドメインの間にsix-helix bundle（6-HB）が形成され、膜融合に向けてウイルスと宿主細胞を橋渡しします。それ故、SARS-CoV-2の膜融合と侵入を阻害する為には、S1、S2両方のサブユニットが重要なターゲットとなり得ます。S2サブユニットの構造は、S1サブユニットよりも保存されている為、コロナウイルスの感染阻害に対しては、より適応性が高いと考えられます。

著者らは、抗ウイルス活性を示すレクチンであるGRFT（oligo mannoseに結合特異性を有する）と、HR1ドメインに対する阻害ペプチドであるEK1を含む二価タンパク質を作り上げ、SARS-CoV-2の変異株やその他コロナウイルスへの阻害効果を評価しています。3種の二価タンパク質（GRFT と EK1を含む）プラスミドを作り上げ、リコンビナントタンパク質を得ました。3種のそれは、GRFTとEK1の間のリンカー構造がその長さという点で異なっており、具体的には次のような3種のリンカー、L15 (GGGGS)₃、L25 (GGGGS)₅、(GGGGS)₇ を使っています。出来上がった3種のリコンビナントは、次のように命名されました、GRFT-L15-EK1 (GL15E)、GRFT-L25-EK1 (GL25E)、GRFT-L35-EK1 (GL35E)。

評価の結果、GL25E 最も優れた阻害効果を持つことが示されました（下図参照）。

National Centre for Biological Sciences (TIFR), Bengaluru, Indiaらのグループは、SARS-CoV-2 感染におけるエンドサイトーシスを利用した感染経路の重要性について述べています。
https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1009706

ウイルス感染におけるキーとなるステップは、ウイルス遺伝子の宿主細胞の細胞質内への放出にあります。これを行うために、ウイルスは細胞膜上の特定の受容体に結合し、引き続いて直接的に細胞膜と融合、あるいはまたエンドサイトーシスによる取り込みに引き続いて細胞膜融合を行います。この両方の細胞感染ルートは、SARS-CoV-2 の感染において起きているようであり、宿主細胞膜上の受容体やプロテアーゼの可用性に依存しています。Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) がSARS-CoV-2の良く知られた受容体でありますが、他の受容体（C-型レクチンなど）や共受容体（ヘパラン硫酸など）が数多くのグループから報告されています。 加えて、SARS-CoV-2 は、侵入を果たすには、宿主細胞のプロテアーゼによるウイルスのSpikeタンパク質の切断を必要とします。それ故、ウイルスは、もしもSpikeタンパク質が細胞膜上のTMPRSS2のようなセリンプロテアーゼによって切断される場合には、細胞膜上で直接的に融合し、そうでない場合には、エンドーライソソーム経路を細胞膜融合に使用し、そこではSpikeタンパク質は、システインプロテアーゼである cathepsinによってSpikeタンパク質がプライム状態になります。このようにして、宿主細胞におけるウイルスの侵入と感染は、これらのキーとなる要素、すなわち受容体（ACE2など）やプロテアーゼ（furin, TMPRSS2, cathepsin）の存在によって大きく影響されます。

CLIC/GEEC (CG) 経路は、clathrin-非依存のエンドサイトーシス経路（CLICｓ）である細管小胞輸送（tubulovesicular primary carriers）によって媒介されます。細管小胞は細胞膜から直接的に発生し、その後グリコシルホスファチジルイノシトール（GPIアンカー）濃縮小胞（GEECs）と呼ばれる細管小胞へと成熟していきます。

著者らは、ACE2の発現をコントロールした胃上皮細胞（AGS）を用いて、SARS-CoV-2 Spikeタンパク質のRBDのエンドサイトーシスを研究しています。AGSは、通常ではACE2を発現していない細胞株として認識されています。 このAGSにおいては、RBDは、clathrin-mediated endocytosis (CME) 経路ではなく、CG 経路によって取り込まれており、AGS細胞における薬理的な擾乱に敏感であることがわかりました。

AGS細胞におけるACE2の効果を調べるために、ACE2を異所的に発現させた安定株（AGS-ACE2）を作りました（ACE2 の発現は、qPCRとウエスタンブロットによって確認されました）。このように改変したAGS-ACE2 細胞においては、RBDの取り込みは、AGS細胞に比べて3倍ほど増加していました。AGS-ACE2細胞におけるRBDの取り込み経路を確認する中において、RBDとトランスフェリンの増加が同時に起こっており、AGS細胞と比較してRBDとdextranの同時取り込みが減少していることがわかりました。 このことは、CG経路に加えて、AGS-ACE2細胞においては、CME経路を介したRBDの取り込みが支配的になっていることを示唆します。

最後に、niclosamide がエンドソーム内pHを中性化し、SARS-CoV-2の感染を抑えることができることが下図のように示されました。治療薬としての可能性を示すものです。